流式細(xì)胞儀是通過內(nèi)置的激光器發(fā)射激光激發(fā)熒光染料，即被488nm或其它特定波長的光激發(fā)后，發(fā)射出另一特定波長的發(fā)射光，并通過光電倍增管或光電二極管將光信號(hào)放大轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)或數(shù)字信號(hào)，并由計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)處理為可讀數(shù)據(jù)。

用激光束激發(fā)兩種或兩種以上熒光染料而發(fā)出不同波長的熒光，從理論上講，可以選擇光學(xué)組件將它們分開，僅使一種熒光被一種熒光探測器收集處理，而檢測不到另外一種熒光。但實(shí)際上由于熒光素的發(fā)射波長是正態(tài)或偏正態(tài)曲線，即有很寬的范圍，熒光素之間的波譜常有重疊現(xiàn)象，如下圖1-1所示。由此，我們需要進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)，補(bǔ)償?shù)膹?qiáng)度將隨著各熒光探測器的放大倍數(shù)（電壓）的變化而變化，特定的電壓對(duì)應(yīng)特定的補(bǔ)償參數(shù)。

圖1-1  FITC和PE發(fā)射光譜

對(duì)于熒光補(bǔ)償?shù)拇_定，需運(yùn)用以上補(bǔ)償?shù)幕驹聿⒔Y(jié)合特定的標(biāo)本來實(shí)現(xiàn)。以FITC,PE雙色分析為例：

（1）先調(diào)節(jié)陰性對(duì)照管：將原補(bǔ)償清零，首先調(diào)節(jié)電壓，通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群落在FITC和PE雙陰性區(qū)。

（2）FITC單染管：在理想情況下（沒有熒光干擾），因檢測管中不應(yīng)該出現(xiàn)PE信號(hào)，但實(shí)際情況是在FITC與PE的雙陽性區(qū)出現(xiàn)了熒光信號(hào)。這個(gè)信號(hào)就是PE探測器檢測到的FITC信號(hào)。此時(shí)需要通過調(diào)節(jié)補(bǔ)償參數(shù)，取合適的補(bǔ)償強(qiáng)度來抵消PE中的信號(hào)。如下圖所示，調(diào)節(jié)補(bǔ)償（PE- %FITC ),使得兩群細(xì)胞FL2的Mean/Median值相同或相近，或通過經(jīng)驗(yàn)判斷（原則為“橫平，豎直”）。當(dāng)PE探測器檢測到的FITC信號(hào)恰好完全消除時(shí)，即PE信號(hào)與陰性對(duì)照一樣時(shí)，PE對(duì)FITC的補(bǔ)償調(diào)節(jié)完成。

（3）PE單染管：同理，將進(jìn)入FITC探測器的PE信號(hào)通過補(bǔ)償調(diào)節(jié)來消除。 

（4）當(dāng)設(shè)置好以上補(bǔ)償條件后，即補(bǔ)償調(diào)節(jié)完畢。

圖1-2 FITC和PE通道補(bǔ)償調(diào)節(jié)

圖1-3 補(bǔ)償不足和過補(bǔ)償?shù)碾p參數(shù)點(diǎn)圖

補(bǔ)償調(diào)節(jié)抗體的正確選擇對(duì)于熒光通道之間的補(bǔ)償調(diào)節(jié)是非常重要的。要求選擇的抗體所結(jié)合的抗原分子在樣本細(xì)胞中有明確表達(dá)，占樣品細(xì)胞的10%以上，50%以下。如果陽性細(xì)胞比例太低，在陽性細(xì)胞區(qū)域無法形成明顯的細(xì)胞團(tuán)，無法判斷調(diào)節(jié)是否合適。如陽性細(xì)胞比例過高，則不表達(dá)該抗原的陰性細(xì)胞無法形成明顯的細(xì)胞團(tuán)，如圖1-4直方圖所示。

圖1-4直方圖

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