l 背景知識

我們都知道，內(nèi)毒素的化學(xué)本質(zhì)是革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖。它可以激活免疫細(xì)胞的受體TLR4 (Toll like receptor4)和TLR2，從而引發(fā)免疫細(xì)胞內(nèi)一系列的反應(yīng)，包括產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，從而啟動先天免疫應(yīng)答（Poltorak, A. et. al., 1998）。

實際上，內(nèi)毒素只是一大類能通過TLR受體家族激活先天免疫系統(tǒng)的供體中的一種。其它的供體還包括細(xì)菌共有的Lipopetide、脂蛋白（Lipoprotein）、鞭毛蛋白（Flagellin）（vison, S. M et. al., 2007）；革蘭氏陰性菌的多聚甘露糖醛酸（Mannuronic acid polymer）、非典型脂多糖（Atypical lipopolysaccharide）、外膜脂蛋白A、膜孔道蛋白（Porin）、外膜蛋白A（Outer membrane protein A）、菌體糖脂質(zhì)（Glycolipid）、菌毛蛋白A（CsgA）；革蘭氏陽性菌的肽聚糖、磷壁酸；分枝桿菌中特有的三乙?；鞍祝?/span>Triacetylated lipoprotein）、二乙酰化脂肽（Diacetylated lipopeptide）、脂阿拉伯甘露糖（Lipoarabinomannan）、結(jié)核分支桿菌的結(jié)核素（STF）；支原體的二乙?；?；錐蟲的糖肌醇磷脂（Glycoinositolphospholipids），弓形蟲的Profilin-like protein；真菌的酵母聚糖；病毒的未甲基化CpG DNA、 ssRNA、 dsRNA，某些病毒的膜蛋白與膜融合蛋白。

這些外源病原性的供體刺激TLR受體家族之后，共有4條信號通路，包括：1依賴于MyD88（骨髓分化基因）信號通路，這是主要通路；2不依賴于MyD88信號通路；3Small GTPase信號通路；4PIP信號通路。四條通路也相互偶聯(lián)成網(wǎng)，激活后面的效應(yīng)途徑，包括有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和NF-κB途徑等等（Oda, K et. al., 2006）。

一旦這些非特異性細(xì)胞免疫途徑激活，作為檢測特異性細(xì)胞免疫的ELISPOT檢測必然會受到干擾。屆時，我們將無法區(qū)別哪些斑點是特異性抗原刺激產(chǎn)生的，哪些是非特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生的。所以，增加ELISPOT檢測可信度，提高檢測重復(fù)性的一個重要環(huán)節(jié)就是要嚴(yán)格控制好以內(nèi)毒素為首的可能干擾ELISPOT檢測的各種TLR供體。

l 應(yīng)對措施

實際實驗中，最容易出現(xiàn)的TLR供體干擾來源是微生物的污染，包括細(xì)菌、真菌和酵母。為了盡可能避免內(nèi)毒素對實驗結(jié)果產(chǎn)生的干擾，重點要做好以下幾個方面：

 1選擇高品質(zhì)的ELISPOT試劑盒，試劑盒內(nèi)的成分應(yīng)該盡量完整。我們推薦達(dá)科為/U-Cytech公司的產(chǎn)品。該產(chǎn)品的質(zhì)量已為國內(nèi)客戶多年的使用所證實，并且試劑盒內(nèi)的各種成分非常齊備，除客戶必須自備的Milli Q和PBS之外，客戶不需要自行準(zhǔn)備其它試劑，避免了引入各種TLR供體而干擾實驗。

作為對比，BD公司和Diaclone公司的ELISPOT試劑需要客戶自行準(zhǔn)備封閉液以及抗體稀釋液，Mabtech公司更是只提供抗體對。特別指出：自行準(zhǔn)備的封閉液，封閉之后會直接接觸檢測細(xì)胞，引入受污染的微生物或者內(nèi)毒素是很普遍的。這就會導(dǎo)致背景變臟，負(fù)對照產(chǎn)生額外的斑點，并且實驗孔中特異性的斑點與非特異性的斑點混雜，最終影響整個實驗的重復(fù)性與可信度。

ELISPOT檢測中，無菌操作部分需要的各種溶液應(yīng)該在潔凈的空間內(nèi)（比如超凈臺內(nèi)）配制，盡量采用過濾除菌的方式。以未包被ELISPOT試劑為例，需要保持嚴(yán)格潔凈的溶液有：潤濕PVDF膜的酒精、洗滌用超純水或者PBS、包被抗體以及抗體稀釋液、封閉液、培養(yǎng)基、刺激物。

在潔凈的空間內(nèi)配制可以有效避免灰塵以及其它污染物。采用過濾除菌可以有效濾除菌體，如果用高壓滅菌，容易引起生物活性成分失活，而且死亡的菌體反而會釋放出更多的TLR供體成分。

使用無內(nèi)毒素的各種耗材、器皿。有些實驗室習(xí)慣于使用一次性塑料耗材培養(yǎng)細(xì)胞或者做實驗，這些耗材確實使用方便，并且能避免污染。但對于ELISPOT檢測而言，最好選用已經(jīng)表明不含熱源的品牌。如果使用可重復(fù)使用的玻璃器皿，注意嚴(yán)格浸泡洗液，嚴(yán)格清洗。內(nèi)毒素或者某些TLR供體的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，只有在濃硫酸/重鉻酸鉀的洗液中或者170°C烘烤4小時才會完全分解。

使用高質(zhì)量的刺激物。

使用達(dá)優(yōu)?無血清培養(yǎng)基。

嚴(yán)格的無菌操作。

總之，內(nèi)毒素以及其它TLR供體是ELISPOT檢測中一大類干擾源。它們并不會導(dǎo)致ELISPOT檢測的完全失敗，故初學(xué)者這些干擾源不會太在意。但是要獲得高質(zhì)量的檢測結(jié)果，增加實驗的可信度與重復(fù)性，一個進階的實驗者必須考慮這些問題了。