通常情況下，某一特定的實(shí)驗(yàn)中可能同時(shí)有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到適合該實(shí)驗(yàn)的二抗，需要綜合以下幾個(gè)方面進(jìn)行考慮：

一抗的物種來(lái)源

一抗是在什么物種來(lái)源的，相應(yīng)的二抗也要是抗該物種的抗體。例如，如果一抗是在小鼠體內(nèi)制備的，那么你就應(yīng)當(dāng)選擇抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔體內(nèi)制備的，那么二抗就應(yīng)當(dāng)是抗兔的抗體。至于二抗本身是在什么動(dòng)物中制備的對(duì)二抗的質(zhì)量并無(wú)明顯的影響。

一抗是屬于哪個(gè)類(lèi)或亞類(lèi)

二抗需與一抗的類(lèi)別或亞類(lèi)相匹配。這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類(lèi)免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。

單克隆抗體的類(lèi)別及亞類(lèi)通常會(huì)在產(chǎn)品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。

如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類(lèi)（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專(zhuān)門(mén)針對(duì)這一亞類(lèi)的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。

如果你不知道一抗是哪一類(lèi)別或亞類(lèi)，那么抗小鼠IgG是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，因?yàn)榇朔N抗體可以識(shí)別大多數(shù)類(lèi)型的IgG免疫球蛋白。

二抗的特異性

下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗：針對(duì)整個(gè)抗體分子（H＋L）具有特異性：如抗IgG(H+L)，此類(lèi)抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合，即與抗體分子的Fc，F(ab’)2/Fab部分（見(jiàn)圖5）均可反應(yīng)，抗IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(yīng)（如IgM和IgA），因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥季哂邢嗤妮p鏈（kappa鏈或lambda鏈）。

針對(duì)Fab片段具有特異性：這類(lèi)抗體與重鏈輕鏈均可以結(jié)合，由于它們可以與輕鏈反應(yīng)，它們同時(shí)也已和具有相同輕鏈的其他種類(lèi)的免疫球蛋白反應(yīng)。

這對(duì)Fc片段或重鏈具有特異性：這類(lèi)抗體和重鏈的Fc部分反應(yīng)，一次它們是類(lèi)別特異性的（即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應(yīng)，mu鏈特異性抗體只識(shí)別IgM，依此類(lèi)推）。

輕鏈（kappa，labmda）特異性：與所有類(lèi)別的抗體反應(yīng)，因?yàn)樗蓄?lèi)別的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。

經(jīng)過(guò)吸附處理的二抗（cross-absorbed）：不同來(lái)源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，一次有些二抗經(jīng)過(guò)了動(dòng)物或人類(lèi)IgG吸附處理，以減少非特異性背景。例如，如果是小鼠的組織或細(xì)胞，那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過(guò)的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體識(shí)別表位的數(shù)量被大大減少。

二抗的形式

選擇哪種形式的二抗，是整個(gè)IgG分子，F(ab’)2片段，還是Fab片段？

整個(gè)IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。

F(ab’)2片段：該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。

Fab片段：它們只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一般用來(lái)封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。

二抗的偶聯(lián)標(biāo)記

一般來(lái)講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過(guò)氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于western blot和ELISA，常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用biotin/avidin檢測(cè)系統(tǒng)。

下面簡(jiǎn)單介紹幾種二抗探針的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用的實(shí)驗(yàn)：

酶：主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物，HRP和AP。比較而言，前者更經(jīng)濟(jì)、快速、穩(wěn)定，而后者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應(yīng)用于免疫組化，western blot 和 ELISA 中，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如ELISA和western blot.

熒光基團(tuán)：

1.FITC：FITC是廣泛使用的熒光基團(tuán)，但其大的缺點(diǎn)是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。

2.AMCA：常用在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，如免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)。其缺點(diǎn)是，淬滅快，且由于肉眼不能很好的檢測(cè)其所激發(fā)的藍(lán)色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測(cè)大量存在的抗原。

3.花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩(wěn)定，且在表面熒光顯微鏡下，Cy2的熒光FITC更強(qiáng)。Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團(tuán)更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。但Cy5的缺點(diǎn)是不能用表面熒光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡觀察。

4.TRITC,RRX,TR:TRITC經(jīng)常和FITC一起用于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，也可以使用RRX或TR，但TR會(huì)產(chǎn)生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因?yàn)?/span>RRX的發(fā)射波長(zhǎng)在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。

5.PE：常和FITC一起用于流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

6.生物素：生物素（biotin）可以和抗生素蛋白（avidin）發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起。首先加入生物素標(biāo)記的二抗，在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團(tuán)的avidin、ExtrAvidin或streptavidin，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個(gè)位點(diǎn)上，從而極大的放大檢測(cè)信號(hào)。

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